格氏乳杆菌G098可以通过减少结肠组织的粘膜损伤、调节免疫反应、恢复肠道菌群多样性和增加肠道菌群稳定性等途径来缓解DSS引起的小鼠结肠炎。
炎症性肠病(IBD)是一种反复发作的胃肠道炎症性疾病，病因尚不明确，但通常被认为与免疫异常和肠道微生物失调等因素相关。而益生菌能调节宿主免疫和肠道菌群；因此，我们研究了格氏乳杆菌G098(G098)对硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎的缓解作用及机制。试验将小鼠分为三组(每组8只)：正常对照组(NC)，DSS诱导的结肠炎小鼠(DSS)，以及给予菌株(G098)的结肠炎小鼠。结果显示，G098给药有效缓解了DSS诱导的结肠炎相关症状(减轻小鼠体重下降，降低疾病活动指数和病理评分；所有情况下的P0.05)，并防止了由于DSS诱导而引起的死亡的发生(DSS组存活率为62.5%；G098组存活率为100%)。同时，G098组的死亡率和炎症症状的改善伴随着更加健康的血清细胞因子平衡。相比DSS组，G098组的血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α显著下降，血清抗炎因子IL-13明显地增加(P0.05)，肠道微生物组的多样性更高，Firmicutes和Lachnoclostridium明显增多，Bacteroidetes明显减少(P0.05)，以及糖降解相关途径的基因丰度明显更高(P0.05)。综上所述，G098的摄入能够最终靠调节宿主免疫和肠道菌群来缓解DSS诱导的结肠炎，菌株治疗是一种有前景的IBD管理策略。
经过1周的适应性训练，小鼠被随机分为三组(每组8只)：NC组、DSS组和G098组。从第0天到第7天，NC组的小鼠自由饮用蒸馏水，而其他组在饮用水中添加DSS(2.5%，w/w)以诱导小鼠发生IBD。从第8天到第17天，NC组和DSS组接受0.9%生理盐水(0.2 mL/d)灌胃，而G098组接受G098乳杆菌(重悬于0.9%生理盐水中，4×109CFU/0.2 mL/d)灌胃。在整个实验过程中，每天观察并记录小鼠的体重、健康状态(腹泻、便血、活动)和死亡情况。在第18天，收集新鲜粪便并储存在-80℃条件下，用十二烷基硫酸钠法提取粪便DNA，用Qubit® 2.0荧光仪进行定量分析，并在Illumina NovaSeq PE150平台上进行DNA测序，由Agilent 2100 Bioanalyzer进行大小分布分析，并使用实时PCR进行定量，最后使用HUMAnN2进行分类学注释。同时通过挥发性异氟醚给药处死小鼠，清除结肠内容物，测量结肠长度和重量。之后，将结肠分为两部分：将远端结肠固定在4%多聚甲醛溶液中，经脱水、染色等操作后利用显微镜进行图像采集，然后通过CaseViewer软件对采集的图像进行组织学评估；其余部分在-80℃下冷冻。收集小鼠血液，通过离心(3000× rpm，4℃，10 min)获得血清，血清样品保存在-80℃，后续用ProcartaPlexTM对几种血清炎症细胞因子水平进行定量。
炎症性肠病(IBD)是一种发生在回肠、直肠和结肠的慢性、非特异性免疫介导的、复发性胃肠道疾病。在过去的250年中，IBD的发病率呈爆炸性增长。肠道菌群对人类健康具有关键作用，它为宿主提供营养和能量，帮助宿主抵御病原体，并调节肠道免疫系统。与健康个体相比，IBD患者的肠道菌群多样性和丰富度较低，宿主肠道菌群的失调状态也将破坏肠道免疫系统的平衡，激活异常的免疫反应。目前，主流的IBD治疗药物包括传统药物、生物制剂和小分子生物制剂等，这些药物最大的作用在于缓解炎症。然而，患者对这些药物医治的反应是有限的，且有许多非常昂贵，并且有严重的副作用，所以迫切地需要找到治疗IBD的新策略。因此，微生物制剂和干细胞移植等新的治疗方法引起了人们的关注，寻找更安全、更有效治疗方法已成为IBD管理的研究热点之一。 益生菌是定植于人体并赋予宿主健康益处的活微生物。以往研究表明，益生菌能够最终靠恢复更平衡的肠道菌群，调节宿主免疫力，增强肠道粘膜功能等途径来缓解IBD的症状。格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)已被证明可以维持肠道健康和调节宿主免疫力。然而，关于格氏乳杆菌缓解溃疡性结肠炎的研究报道很少。格氏乳杆菌G098是以前从中国西藏自治区市一个健康婴儿的肠道中分离出来的菌株，该菌株对人工胃肠液和胆汁盐表现出良好的耐受性，是一株潜在的益生菌株。本研究旨在研究格氏乳杆菌G098能否以及如何改善肠道生态系统并缓解DSS诱导的IBD模型小鼠结肠炎的相关症状，重点是调控炎症细胞因子水平和肠道菌群的组成和多样性。
在动物试验中，NC组和G098组的所有小鼠全部存活，但DSS组的三只小鼠分别在第8、10和14天死亡，最终存活率为62.5%(图2A)。在第1至7天，DSS组和G098组的DAI评分(根据体重减轻、腹泻和血便计算)显示出上涨的趋势，但NC组没有。在第7天，DSS组和G098组的DAI评分明显高于NC组(P0.0001)，而DSS和G098组之间无显著差异(图2B)，证实DSS处理导致DSS和G098组小鼠出现结肠炎。与DSS组相比，10天的菌株干预明显降低了G098组小鼠的DAI评分(P＜0.05；图2C)和体重减轻(P＜0.05；图2D)。此外，与DSS组相比，G098组小鼠的结肠长度/重量比增加(P0.05；图2E)。 DSS组的结肠组织病理学评分明显高于NC组(P＜0.05，图2F)，而G098的组织学评分明显低于DSS组(P＜0.05，图2F)。NC组、DSS组和G098组结肠组织的典型显微照片见图2G。NC组小鼠结肠的粘膜、粘膜下层、肌肉和质膜层都很完整，无显著的病理变化。此外，肠道腺体发育良好，杯状细胞丰富，无显著的炎症细胞浸润。G098组小鼠的肠道粘膜层表现出类似的组织学特征，只有少量的炎症细胞浸润，但局部肠腺结构无显著变化。相反，DSS组的小鼠结肠粘膜局部上皮细胞脱落，肠腺结构不明显，杯状细胞减少，粘膜固有层有明显的炎症细胞浸润。这些根据结果得出，G098的干预可以明显防止DSS处理引起的结肠粘膜和局部肠腺结构的病理损伤。
图2 正常对照组(NC)、硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组之间炎症表现的差异。
(A)各组存活率。(B)疾病活动指数的变化。(C)第17天相对于基线的疾病活动指数的变化。(D)第17天相对于基线的体重变化。(E)结肠长度/重量比。(F)组织学评分。(G)结肠组织的苏木精和伊红染色显微图像(40×和150×放大)，显微图像(150×放大)是红色箭头所示区域的放大图像。误差线代表平均值的标准偏差。统计分析采用Tukey多重比较检验(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)。
2摄入格氏乳杆菌G098可逆转DSS引起的血清促/抗炎细胞因子水平的变化
Simpson指数和Shannon指数是衡量微生物多样性的指标。与NC组相比，DSS组小鼠的Simpson和Shannon指数值明显降低(分别为P0.05和P0.05)，G098给药缓解了DSS引起的肠道微生物多样性的减少(两种情况下均为P0.05；图4A、4B)。然后，通过主坐标分析(PCoA；Bray-Curtis距离；图4C)对小鼠肠道菌群的β-多样性做多元化的分析。在PCoA图中，代表NC组的符号聚集在一起，而代表DSS和G098组的大多数符号在图中的位置很接近。t检验证实，正常小鼠和DSS处理的小鼠肠道菌群结构在有/无菌株处理时存在很明显差异(NC vs DSS，R2=0.3955，P=0.005；NC vs G098，R2=0.2033，P=0.002)。然而，G098处理可以在某些特定的程度上减少这种差异(R2=0.1534，P=0.117)，尽管G098组和DSS组之间有部分重叠(图4C)。
图4 正常对照组(NC)、硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组的肠道菌群分类。
火山图显示了在肠道菌群中检测到的代谢途径的P值(t检验)和倍数变化(FC)(共228条代谢途径；图5A)。与DSS组相比，G098组检测到5条显著增加的代谢途径，包括D-半乳糖降解V(Leloir途径)、半乳糖降解I(Leloir途径)、水苏糖降解、CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate生物合成I和L-谷氨酸降解V(通过羟基戊二酸)(P0.05和FC≥2或≤0.5；图5A)。
(A)火山图显示葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导组和格氏乳杆菌G098(G098)组的肠道菌群之间的差异代谢途径(临界值：P0.05和FC≥2或≤0.5)，每个点代表一个检测到的途径，差异代谢途径以红色显示并有注释。(B)Spearman相关热图显示了差异类群、代谢途径、血清细胞因子水平和疾病活动指数之间的关联。*和**分别代表P0.05和P0.01，色标代表r值。
本研究分析了在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中施用格氏乳杆菌G098对IBD临床表现的有益影响。研究结果为格氏乳杆菌G098能有效缓解结肠炎相关症状，并伴随着小鼠肠道菌群和代谢途径的一些变化。 本研究通过连续7天在饮水中给予2.5%的DSS(W/V)，成功诱导小鼠结肠炎，模拟了IBD症状。DSS组的小鼠体重下降，且肉眼可见小鼠粪便松散带血。在第7天，DSS组的DAI评分明显高于NC组(图2B)。用G098干预10天后，DAI评分显而易见地下降，扭转了体重下降的趋势，并减轻了DSS引起的结肠炎症状(图2C-E)。通过HE染色对小鼠结肠病理进行了观察和评分，发现G098可以明显缓解DSS诱导的结肠组织中的肠腺损伤，同时大幅度的降低了炎症细胞的浸润程度，病理评分与DSS组相比也明显降低(图2F-G)。这些结果均表明G098能有效缓解IBD相关的症状。重要的是，在整个实验过程中，G098组小鼠没有死亡(而DSS组的存活率为62.5%；图2A)，进一步证实了G098的摄入对DSS诱导的疾病的保护作用。 有研究认为，不同细胞因子的水平和功能与IBD的严重程度紧密关联，通过调控细胞因子的分泌可以缓解肠道炎症。IL-1β和IL-6是两种关键的促炎细胞因子，参与了多种自身免疫性炎症反应和细胞活动。另一方面，TNF-α在IBD的发病机制中同样起着及其重要的作用，它能诱导结肠上皮细胞大量凋亡，参与固有层的炎症反应和上皮细胞脱落，增加肠道屏障细胞的通透性，从而加重炎症反应。此次研究发现，在DSS处理的小鼠中，G098的给药具有普遍的抗炎作用，表现为促炎症和抗炎症细胞因子水平的降低和增加(图3)，这可能是保护小鼠免受结肠炎的重要机制。 众多研究表明，结肠炎的发生和缓解与肠道菌群紧密关联，IBD患者的肠道菌群多样性降低，微生物群结构和组成发生改变，Escherichia coli等有害细菌水平升高，Firmicutes和Alistipes等有益细菌丰度降低。微生物宏基因组分析发现DSS与NC小鼠之间以及DSS与G098小鼠之间有不同的细菌家族(图4D-F)。然而，在DSS干预后，Akkermansia muciniphila相对丰度的变化趋势与以往的研究不同。这种差异可能与动物模型、是否与其他致病菌共存以及宿主性别等因素相关，值得进一步研究。 本研究之后发现，G098的摄入可以明显提高DSS组肠道菌群的α-多样性(图4A、4B)，缩小DSS组和NC组小鼠之间肠道菌群结构组成的差异(图4C)。G098处理也显著提升了肠道Firmicutes的相对丰度，同时降低了肠道Bacteroidetes的比例(图4D-E)。G098给药后Firmicutes/Bacteroidetes比例的增加表明该菌株可以有效逆转DSS引起的微生物群失调。在属水平上，G098组Lachnoclostridium的相对丰度明显高于DSS组(图4H)。SCFAs与肠道炎症紧密关联，它们参与了抗炎信号的多种代谢途径。此外，本研究之后发现Lachnoclostridium与抗炎因子IL-13之间有显著正相关关系(图5B)，表明G098给药对调节宿主肠道免疫反应具有潜在作用。另一方面，以往的研究发现，DSS组的Desulfovibrio比益生菌干预组更丰富，与当前G098组Desulfovibrio比例较低的结果相反(图4G)。Desulfovibrio能在肠道内产生硫化氢(H2S)，对肠道上皮细胞有毒性，引起胃肠道疾病。然而，已经发现H2S可以直接促进血管生成，因此有利于胃肠道溃疡的愈合，这可能是由于溃疡边缘的粘膜血流增强，促进溃疡修复。 最后，采用HUMAnN2来识别肠道微生物组编码的潜在功能途径，结果显示共有228条通路。与DSS组相比，G098组编码的基因丰度较高，包括糖降解相关途径(如水苏糖降解、D-半乳糖降解V(Leloir途径)和半乳糖降解I(Leloir途径)，以及L-谷氨酸降解V(通过羟基戊二酸)；图5A)。谷氨酸是产生乙酸盐和丁酸盐等SCFAs的主要的组成原材料，肠道SCFAs在肠道上皮细胞的能量供应、电解质平衡、维护肠道粘膜屏障、调节免疫和抗肿瘤作用方面发挥着重要的生理作用。L-谷氨酸降解V(通过羟基戊二酸)的代谢途径与Lachnoclostridium呈显著正相关，Lachnoclostridium是一个已知产生SCFAs的细菌属。因此，G098可能刺激编码上述途径的部分肠道菌群生长，并调节部分生理功能，包括SCFA的产生和加强肠道粘膜屏障，缓解肠道炎症。 综上所述，格氏乳杆菌G098治疗可以缓解DSS诱导的小鼠炎症性肠病的症状。未来，要进一步探索格氏乳杆菌G098缓解结肠炎的具体机制，并继续开展相关的纵向研究，为应用格氏乳杆菌G098治疗和防治IBDs提供更多证据。
本研究表明，格氏乳杆菌G098可以通过减少结肠组织的粘膜损伤、调节免疫反应、恢复肠道菌群多样性和增加肠道菌群稳定性等途径来缓解DSS引起的小鼠结肠炎。未来应进一步评估格氏乳杆菌G098对IBD的临床疗效，以及格氏乳杆菌G098缓解实验性结肠炎的具体机制。